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  遷移實(shí)驗(yàn)（cell migration assay）

 實(shí)驗(yàn)材料
（1）ThinCert插入式細(xì)胞培養(yǎng)器: 24-well, 8.0-μm pore membranes （Greiner662638）

（2）細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無(wú)血清培養(yǎng)基，10％血清培養(yǎng)基，PBS，0.02％EDTA

（3）固定液：甲醇

（4）染色液：Giemsa染液

（5）封片劑：中性樹(shù)膠

（6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片

 操作步驟

（1）所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和ThinCert放在37℃溫育；

（2）待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用PBS和無(wú)血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，

 用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度  為2×105 /ml；

（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培養(yǎng)基，上 室加入100－

 150μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時(shí)；

（4）用鑷子小心取出ThinCert，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800μl甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；

（5）取出ThinCert，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800μl Giemsa染液 的孔中，室溫染色15－30分鐘；

（6）輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出ThinCert，吸去上室液體，用濕棉棒小 心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；

（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹(shù)膠封片；

 （8）顯微鏡下取9個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

  注意事項(xiàng)

（1）根據(jù)待測(cè)細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的ThinCert。常用的為8.0-μm孔徑（如

  AGS細(xì)胞），如果細(xì)胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑；

（2）根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間。常規(guī)24-well  ThinCert接種細(xì)胞數(shù)約

 為2≈5×104/well， 遷移時(shí) 間 12≈36小時(shí)；

（3）由于Greiner公司的24-Transwell內(nèi)含24個(gè)獨(dú)立的ThinCert，為了避免操作污染，

 每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊24孔普通培養(yǎng)板（Greiner）；

（4）如果細(xì)胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)獲得 的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），

 具體可查  閱相關(guān)文獻(xiàn)；

（5）細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；

（6）固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細(xì)胞，

 以免影響讀數(shù)。尤其是  膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；

（7）Chamber和膜上都無(wú)法標(biāo)記，操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；

（8）充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。